依據(jù)國標(biāo)GB T32098-2015對生物發(fā)酵法中有機(jī)酸的分類，單羧酸和二元羧酸在發(fā)酵食品中普遍存在。本文采用液相色譜儀以及復(fù)合模式色譜柱對發(fā)酵食品中4種單羧酸進(jìn)行分離，流動相中未添加離子對試劑，也沒有使用高水相體系，配合 WAX-1色譜柱，提高了4種有機(jī)酸的分離和保留。4種有機(jī)酸在其適宜的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（10-1000ug/mL，r-2=0.9999），LOD在1.1~1.4μg/mL之間，LOQ在4~5μg/mL之間，均能滿足發(fā)酵食品中單羧酸的檢測要求。

【儀器/耗材清單】

1.1 儀器：高效液相色譜儀LC-1000型，配置紫外檢測器，分析天平，離心機(jī)，組織搗碎機(jī)，研缽，三角瓶，水浴鍋，過濾器

1.2 WAX-1色譜柱（250mm×4.6mm，5um）

【實(shí)驗(yàn)/設(shè)備條件】

2.1 乙腈（色譜純）；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q去離子水；磷酸er氫鉀（色譜純，99%） 磷酸（分析純）

2.2 測試用標(biāo)準(zhǔn)品：甲酸（LCMS純）乙酸（LCMS純）；乳酸（食品級，95%），丁酸（色譜級）

2.3 色譜條件

色譜柱：Thermo Acclaim Mixed-Mode WAX-1（250mm×4.6mm，5um）

柱溫：30 ℃；

進(jìn)樣量：10 μL；

流速：0.8ml/min；

檢測波長：UV210nm；

流動相：乙腈：25mmol磷酸er氫鉀（磷酸調(diào)PH3.93）（40:60），等度洗脫。

【樣品提取】

3. 1 儲備液：分別精確稱取四種有機(jī)酸適量，水溶解，配制儲備液 1000 μg/mL。

3.2 系列標(biāo)準(zhǔn)曲線：水溶劑，配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液10μg/mL– 1000μg/mL

3.3 供試品：精密稱取酸奶1.2g，加8mL水，振搖1min，定容到10mL，4500r/m離心10min，過濾，取續(xù)濾液作為上機(jī)溶液。精密稱取固體酵素1g，加8mL水，振搖1min，定容到10mL，4500r/m離心10min，過濾，取續(xù)濾液作為上機(jī)溶液。

【實(shí)驗(yàn)/操作方法】

4.1 重復(fù)性測試

采用上述儀器分析方法，4種單羧酸在20分鐘內(nèi)均可獲得良好的色譜峰，分離效果良好。圖1為四種有機(jī)酸200ppm濃度色譜圖，各峰面積及保留時(shí)間RSD%值均小于0.6%，其中各化合物測試結(jié)果見表2。

4.2 線性范圍測試

采用上述儀器分析方法，對4種有機(jī)酸進(jìn)行線性范圍測試，線性相關(guān)系數(shù)r2均大于0.999，線性關(guān)系良好。4種有機(jī)酸線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)、LOD（S/N>3）及LOQ（S/N>10)結(jié)果見表2，化合物線性方程圖見圖2。

4.3 樣品測試

對市售的發(fā)酵酸奶和固體酵素飲料進(jìn)行有機(jī)酸檢測，乳酸均檢出，其他干擾物與乳酸及其他幾種有機(jī)酸位置互不影響。

【實(shí)驗(yàn)結(jié)果/結(jié)論】

4.1 WAX-1色譜柱獨(dú)特的復(fù)合模式鍵合相，同時(shí)兼具反相和弱陰離子交換兩種交換模式，此方法報(bào)告中4種有機(jī)酸主要通過離子交換模式進(jìn)行保留，相比C18而言，具有不需要高水相，不需要添加離子對試劑的優(yōu)勢。方法重復(fù)性良好，4種有機(jī)酸在10-1000ppm范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，高濃度有機(jī)酸峰形尖銳對稱。

4.2 本方法非常適合用于發(fā)酵食品中單羧酸的檢測。