高效液相色譜方法的開發(fā)是一個(gè)繁復(fù)的過程，但不管再繁復(fù)，也有其規(guī)律可尋。方法開發(fā)過程中，一個(gè)總的原則是：先找到目標(biāo)化合物的峰，然后調(diào)整峰形，再是進(jìn)一步完善。
找到目標(biāo)化合物的峰：
要找到目標(biāo)化合物的峰，我們該如何開展工作，先舉一個(gè)例子，下面是分析氟康唑氯化鈉注射液的一個(gè)譜圖：
譜圖上的內(nèi)容主要包括：色譜柱、波長、流動相、溫度、流速和進(jìn)樣量這幾項(xiàng)。這意味著如果這幾個(gè)色譜條件都確定下來了就可以基本認(rèn)為這個(gè)方法已經(jīng)開發(fā)成功，所以開發(fā)方法時(shí)我們可以通過逐一的考查這幾個(gè)色譜條件來進(jìn)行。
考查色譜條件是需要通過在色譜儀上進(jìn)樣來進(jìn)行的，這就需要我們首先確立一個(gè)初始條件，即回答從何開始的問題。在回答好“從何開始”這個(gè)問題之前，我們先要了解我們的被分析物，就像一場戰(zhàn)爭，首先要知道自己的敵人是誰一樣，我們要了解它的物理、化學(xué)性質(zhì)，特別是化學(xué)結(jié)構(gòu)式非常關(guān)鍵。所以，色譜方法開發(fā)工作可以通過如下的步驟來展開：
1）收集資料：
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對它的分子量、結(jié)構(gòu)式，以及在水、甲醇、乙腈、四氫呋喃、正己烷和異丙醇中的溶解度有一個(gè)初步的了解。對分子量的了解在選擇色譜柱的過程中是非常重要的，因?yàn)樯V柱填料的孔徑對化合物的分離具有重要的影響，例子如圖：
由此可以看出填料孔徑對分離度和峰形是有一定影響的，120A的色譜柱通常適用的范圍為分子量<10000的，如果分子量太大，在填料為120A孔徑的柱子上分離度會比較差，因?yàn)闃悠贩肿釉谏V柱上有較好的保留是由于可以進(jìn)入到填料的微孔里面，與鍵合在表面上的C18長鏈相互作用，通?？讖街睆叫枰笥诜肿又睆降?倍以上才不會對分析造成影響。因此一般分子量10000一下的化合物建議用120A的柱子來分析，分子量大于1W小于20W的用300A的來分析，分子量大于20W的就要用凝膠柱了。
結(jié)構(gòu)式對于分子極性大小的預(yù)測以及后續(xù)調(diào)整峰形時(shí)具有非常重要的作用，如－COOH、－NH2、－NHR、－NR2、－OH等都是極性基團(tuán)，而苯環(huán)、己環(huán)、－CH＝、－CH2－CH3等都是非極性基團(tuán)，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)大致對其極性做一下判斷，估計(jì)一下可能在C18上（用得最多，我們最熟悉）的保留性能如何，再結(jié)合目標(biāo)化合物在上述所說的幾種溶劑中的溶解度狀況，對方法開發(fā)時(shí)可能用正相柱還是反相柱來作一個(gè)粗略的判斷，以及方法開發(fā)完成后的認(rèn)證有作用。
2）選擇色譜柱
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I）填料孔徑的選擇：根據(jù)所查資料獲得的化合物分子量信息來確認(rèn)色譜柱填料的孔徑；
II）填料鍵合相（鍵合相是指C18、C8、苯基柱等）的選擇：在沒能查到做過該樣品的相關(guān)資料之前，或者并不了解其極性之前，通常最好選擇C18柱作為初始的色譜條件。因?yàn)镃18柱是我們用得最多的，也是對其色譜保留性能最了解和熟悉的，在C18柱上獲得的信息我們可以預(yù)測其極性，以及為解決遇到的問題問題下一步可能將采取的措施。
III）填料粒徑、色譜柱型號的選擇：在沒有特別指明之前，最好使用我們常用的5um、4.6×150mm或250mm，和前面首選C18作初始條件一樣，是為了方便預(yù)測其保留性能。
3）檢測器和波長的選擇
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目前使用最為普遍的是UV檢測器，因此，在不了解其是否有紫外吸收的情況下，我們先要了解其這一性能，用標(biāo)準(zhǔn)品配成合適的溶液進(jìn)行紫外掃描，收集目標(biāo)化合物最大吸收波長的數(shù)據(jù)，確定波長；
或者是在有DAD檢測器的條件下進(jìn)幾針標(biāo)準(zhǔn)品溶液，通過DAD的三維譜圖可以獲得化合物最大吸收波長的相關(guān)信息。
如無紫外吸收，則需選用合適的檢測器。因?yàn)闄z測器是我們監(jiān)測化合物是否出峰的工具，是我們的能看到化合物的“眼睛”，也是我們開發(fā)方法的基礎(chǔ)，因此非常重要，需認(rèn)真選擇。
4）流動相的選擇
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流動相的選擇需要根據(jù)檢測方式來確定，這里以UV檢測器為例。液相的流動相最常用的體系有兩種，一種是甲醇和水的體系，一種是乙腈和水的體系。
這兩種流動相體系沒有太大的差異，但還是區(qū)別的：
主要區(qū)別在于：
1）甲醇價(jià)格比乙腈便宜很多；
2）乙腈的洗脫能力比甲醇強(qiáng)；
3）甲醇在紫外上的吸收截止波長在210nm左右，也就是說在210nm以下基線的本底會比較高，與乙腈相比會大大降低化合物的峰高，削弱目標(biāo)化合物的檢測靈敏度；
乙腈的吸收截止波長在190nm左右；如果確定的波長在210nm以下，則應(yīng)該選擇乙腈和水作為流動相體系，如果遠(yuǎn)離這個(gè)波長的地方，則甲醇應(yīng)該是首選。
5）流速的選擇：與上述所確定的色譜柱型號相對應(yīng)的流速，4.6mm內(nèi)徑色譜柱選1ml/min。
6）溫度的選擇：如化合物對溫度沒有特別的需求（如溫度高了不穩(wěn)定等），則在方法開發(fā)之初，盡量使用室溫，這樣開發(fā)出來的方法普適性會比較廣一些。升高溫度往往在后面為了提高目標(biāo)化合物與其它雜質(zhì)的分離度時(shí)使用的，或者為了降低柱壓等，在進(jìn)一步優(yōu)化色譜條件時(shí)才去考慮。
綜合以上所選擇的一些條件作為初始條件，就可以開始下一步的目標(biāo)——“找到目標(biāo)化合物峰”。要找到目標(biāo)化合物的峰，首先就要在我們最熟悉的C18柱上面測試一下，了解化合物的保留能力和大致的極性。
具體的步驟是：先用純甲醇做流動相，看化合物是否被洗脫下來，如果被洗脫下來峰高是多少，收集這些數(shù)據(jù)；
然后流動相中甲醇的比例以10％的速度遞減，即甲醇：水＝90：10、80：20、70：30。。。。純水，看流動相從最初的100％甲醇——100％水的過程中每變動10％的比例，譜圖上會多些什么峰，峰高會不會發(fā)生變化，多出來的峰是從哪里來的；
這個(gè)過程會有三種結(jié)果：
1）純甲醇條件下沒能洗脫下來，這樣說明化合物的極性很弱，保留能力非常強(qiáng)，應(yīng)該可以考慮用正相體系來做，如選擇硅膠柱；
2）純水條件下很難出峰而純甲醇時(shí)很快洗脫下來，這意味著我們可以通過調(diào)整流動相的比例找到這個(gè)峰，并結(jié)合前面流動相比例10％變化的系列數(shù)據(jù)，選擇合適的流動相。
3）純水條件下也仍然很快就出峰，這說明化合物的極性很強(qiáng)，此時(shí)需要結(jié)合分子的結(jié)構(gòu)式來判斷，有可能是哪些基團(tuán)導(dǎo)致了樣品這么快的出峰，然后采取相應(yīng)的對策，考慮添加緩沖鹽，調(diào)節(jié)pH，如果需要的話，甚至考慮添加離子對試劑。
