一. 安裝、啟用和維護中重點注意事項
色譜柱既是液相色譜儀的最核心部件，價格相對昂貴，請牢記它是高檔儀器中的高檔部件，給它以足夠的尊重和關懷。如避免強烈的碰撞和震動，盡管色譜柱從1米高的實驗臺掉落到水泥地上不至于100%會損壞，但50%的可能損壞你也承受不起。另外不要讓柱床變干，避免在嚴寒環(huán)境受凍等。
01、柱頭類型和不銹鋼毛細管接頭的匹配
色譜柱是消耗品，不是儀器原配的情況很多。如果接頭和柱頭深度不匹配將會產生漏液或者死體積過大的現象。接頭比柱頭深度長，不易擰緊而漏液；接頭比柱頭深度短，柱頭內留有空隙而產生死體積，使譜帶展寬和峰拖尾。
02、溶劑的匹配轉換
色譜柱內保存溶劑和儀器系統(tǒng)內存留溶劑，如果和流動相不匹配，使用前需進行轉換。特別是流動相含緩沖鹽時，如保存溶劑是純有機相或有機相比例高，直接將新柱接入使用，會導致緩沖鹽在柱內結晶析出，最嚴重會將新柱永久不可逆地損壞。正相柱保存溶劑一般為正己烷，如果要轉換成HILIC柱模式使用，由于正己烷和甲醇乙腈的互溶性不好，轉換中間需用二氯甲烷或乙酸乙酯過渡。
03、新柱使用前的平衡和老化
廠家出廠檢驗時一般都已進行過平衡，但色譜柱到最終用戶時間不一，用戶正式測定前最好對色譜柱再次平衡。最好的平衡兼老化一起進行的方法是運行幾次完整的分析程序（包括進樣），直到觀察到峰形、保留時間和峰面積穩(wěn)定為止。所謂“老化”是借用了氣相的術語，目的是達到分析物在色譜柱以及整個液相系統(tǒng)流路中的吸附飽和。對某些特定的待測物，如分子量大于1000的，因擴散速度慢，老化時間相應要長，可采取大濃度進樣或在同一個洗脫周期內連續(xù)進樣多針的方式加快老化。
04、 pH使用范圍
一般認為硅膠基質柱子的pH使用范圍是2-8，這是很粗略的。硅膠類型、使用溫度、硅膠表面所鍵合的固定相類型以及緩沖鹽的不同，對此均有影響。硅膠比孔容小、鍵合密度大的填料pH耐受范圍要大一些，如月旭公司的Ultimate XB-C18色譜柱，選用的是高品質硅膠，加上高密度鍵合和雙封尾，使pH耐受范圍最大提高到10。磷酸鹽緩沖鹽滲透力強，有加快硅膠溶解的副作用，它的存在會降低pH使用范圍。有機雜化硅膠以及硅膠表面涂覆雜化層的硅膠填料，有機質的存在使pH使用范圍能到12以上，月旭公司的Xtimate系列產品即屬此類。
05、色譜柱保存
短期保存(隔夜或隔周末)用所用的流動相（不含緩沖鹽）保存為佳，以盡量減少下次使用的平衡時間。一般只建議在長期保存反相柱的時候用純甲醇或乙腈，一方面純有機相保存有最大限度減少鍵合相水解的作用，但純甲醇（乙腈）又會將已水解而暫時吸附在柱內的鍵合相洗脫出去，使固定相流失進程加快，壽命縮短。純有機相保存還有易揮發(fā)使柱床變干的缺點，使用80%左右有機相保存也屬好的選擇，且足以避免長菌。強烈建議在柱身上貼標簽標明保存溶劑。
CN基柱在有機極性溶劑中柱床不穩(wěn)定（會導致柱床結構坍塌），適合在水相中低溫保存。低溫保存要確保不發(fā)生固定相凍結而損壞柱床。離子交換柱和水性SEC柱等適合保存在水溶液中的色譜柱，可加0.05%疊氮化鈉溶液防止長菌。
正相柱，無論是短期還是長期，都推薦保存在所用流動相中。
上面是基本色譜分離方程式，分離度R和柱效（N）、選擇因子（?）以及容量因子k'相關，和柱壓無關。但柱壓（P）仍不失為 HPLC方法中的最重要參數之一，因為柱壓反映了色譜柱的內部狀況?，F今能承受400 bar壓力的HPLC泵很常見，色譜柱如在遠低于上限的壓力下正常運行，不需要我們重點關注；當柱壓升高接近上限或者柱壓有異常升高，往往意味著色譜柱出狀況了，需及時進行維護和補救，嚴重時色譜柱就已報廢了。本節(jié)將詳細考察柱壓問題并提出可行的解決方案。
二. 柱壓方程
對填充色譜柱，柱壓與黏度 (η)、柱長 (L)和流速 (F)成正比，與填料粒徑（d p）以及柱管半徑（r）的平方成反比。K0是比滲透性系數，對填充床，其值約為0.001。通過此公式可近似計算出給定色譜條件下的理論柱壓。只有當新柱實際測得的柱壓和理論柱壓相差很大，才能說柱壓存在問題。
黏度 (η)取決于流動相溶劑的選擇，為降低柱壓，反相色譜中傾向于選擇低黏度的乙腈，而不是高黏度的異丙醇。當然選擇時還需考慮溶劑強度、極性、分析物的溶解度以及和分析物兼容性等。柱長（L）增加可以提高分離度（R），流速（F）提高能加快分離，但都會導致柱壓上升，選擇確定這些運行參數時，需綜合平衡和折中。
填料粒徑對柱壓影響極大，d p降低一倍，柱壓將增加4倍。UHPLC中采用的sub-2 μm填料，柱壓超過普通HPLC泵的400Bar上限很多。提高柱溫因可降低黏度η，相應降低柱壓。在梯度洗脫時，黏度隨流動相組成的變化而改變，柱壓也會處在不斷變化中。對水/甲醇流動相體系，在55：45時，黏度和柱壓有個極大值。
內徑的影響同樣很大，根據線流速相同柱壓相同的原則，4.6mm內徑的色譜柱流速為1ml/min，約相當于在2.1mm內徑色譜柱上的0.2ml/min流速，在10mm半制備色譜柱上的5ml/min，計算公式為v＝1.0ml/min x（內徑r/4.6）2。所以在換不同內徑色譜柱時，請及時調整流速，以免因高柱壓損傷色譜系統(tǒng)。
柱壓下降是儀器系統(tǒng)的連接有泄漏，柱壓不穩(wěn)定一般認為是流路中有氣泡或空穴，和色譜柱相關的柱壓問題是柱壓上升。
三. 色譜柱結構
和柱壓相關最大的是進口端篩板（inlet frit）以及其后面1-2cm長度的柱頭填料。篩板上有比填料粒徑小的小孔，篩板上的小孔或柱頭填料的間隙被部分堵塞，是柱壓上升的主要原因。有以下幾類情況：
1、填料破碎和使用后有填料粉末生成
填料破碎一般在裝柱過程中發(fā)生，裝柱壓力過大或所選硅膠機械強度過低所至，設定柱壓出廠標準可解決；流動相中高pH值緩沖鹽使硅膠溶解并重新形成填料粉末，堵塞出口端篩板，這種情況下反沖不起作用，只有更換后篩板，不過打開承壓的后篩板，對柱床會有不好影響。
2、顆粒物堵塞引起柱壓上升和對策
可能堵塞進口端篩板（前篩板）和柱頭填料間隙的顆粒物來源有：樣品（制樣時灰塵和濾紙等帶入）、進樣閥密封圈磨損、流動相（溶劑本身含有和配制過程進入）、液相儀器中泵閥密封圈的磨損、緩沖鹽析出（一般在梯度運行和進樣時鹽的溶劑環(huán)境改變導致）。
水和緩沖鹽流動相內生長的細菌，也是顆粒物來源的一種，可堵塞篩板和填料間隙。應避免將這類流動相在室溫下久放，可放入冰箱存放。
1) 預防措施
樣品（甚至標準品）和流動相過濾，既預防了篩板、柱頭和毛細管堵塞，又能減少進樣閥、活塞桿和截止閥等儀器關鍵部件的磨損。普通用0.45um孔徑濾膜過濾樣品和流動相，對使用2um以下填料的超高壓柱的，可用0.20um濾膜。濾膜材質有再生纖維素、聚四氟乙烯、尼龍、硝酸纖維和醋酸纖維等，須根據和樣品溶劑及分析物的適應性慎重選擇。
使用保護柱或在線過濾器，具體安裝位置見下圖：
在線過濾器內裝有可更換的濾片，濾片孔徑一般有2um和0.5um兩種。安裝位置有兩個可選擇，在進樣器和色譜柱之間時，對樣品和流動相中的顆粒物都有效；在泵和進樣器之間，則只對流動相有過濾作用。
保護柱是縮小版的色譜柱，內含帶填料的可更換的柱芯，安裝在進樣閥和色譜柱之間，用于防止色譜柱的化學污染為主，也有過濾顆粒物的作用。
2) 故障排除
反沖色譜柱：不連接檢測器，直接將堵在前篩板上的顆粒物沖出排到廢液瓶中。開始時反沖壓力可低于正常使用壓力，待顆粒物有沖出后，逐步提高沖洗壓力。有時顆粒物已非常牢固嵌入到篩板內部，反沖不一定湊效，早反沖、勤反沖相對效果更好。有的廠商為避免堵塞，使用了較大孔徑（2-5um）的前篩板，這種情況反沖會將填料沖出。
換篩板：一般不建議這樣做，因為換篩板會帶走粘在篩板上的部分填料，使柱床的均一性受影響，導致柱效下降。不過如果反沖不能解決問題，也只能不得已而為之，要不然就要把色譜柱報廢了。
如果系統(tǒng)中不接色譜柱，柱壓仍然高，說明泵出口到色譜柱之間的其它部位，包括進樣器、在線過濾器和保護柱等有堵塞，可逐一排查。為了減少死體積，毛細管都做得盡可能的細，也可能被堵。
3、化學污染物引起柱壓上升和對策
來源同樣是樣品、流動相和系統(tǒng)，不過來源于樣品的污染最普遍，特別是對復雜基體樣品未經前處理或前處理不夠的時候。化學污染物主要有：分子量很大的化合物、鹽類、脂質、蠟類、油脂、腐殖酸、蛋白質等其它生物來源的物質。
像鹽類這樣的保留能力極小的污染物會在死體積處很快從柱中洗脫出去，檢測器一般對此類物質響應不大，有時表現為干擾峰、基線波動、斑點甚至負峰。
保留能力中等的污染物，會被慢慢洗出色譜柱，表現為寬峰、基線饅頭形波動和基線緩慢漂移。
對強保留的污染物，一般流動相強度不足以將其從柱中洗出，會逐步在柱頭累積。有時，累積在柱頭的污染物可作為新固定相對分析物起作用，引起保留時間改變、峰拖尾和峰分叉等。污染物在柱頭累積到一定程度，如果不采取措施，會堵塞填料間隙，引起柱壓上升。最好的辦法是選用合適的溶劑沖洗溶解這些物質，同時又不對填料本身有損害。如聚合物柱中累積的蛋白類污染物可用pH13-14的強堿溶液洗掉，但這種方法不適合硅膠基質色譜柱。
1）預防措施：
a．制樣時采用SPE固相萃取等方法，預先將色譜柱殺手類的污染物質清除掉；
b．連接保護柱。保護柱是分析柱的延伸，在填料類型和粒徑上應于分析柱一致，才能最大限度起保護作用，又不影響色譜性能。一個設計和裝填良好的保護柱，還可增加分析柱的分離效率。如果因某種原因需在保護柱中用不同的填料，也應選擇比其所保護的分析柱保留能力弱的固定相，這時的保護柱完全用于截住強保留物質，類似于SPE小柱的功效。當保護柱柱芯保護功能用盡時，也不能說不可再清洗后復用，但價格低不值得去花這個時間。
c．經常對分析柱進行沖洗維護。
2)故障排除：
已經累積很多污染物，用甲醇或乙腈簡單沖洗不奏效，推薦使用下面方法清洗反相柱100％甲醇—100％乙晴—75％乙晴/25％異丙醇—100％異丙醇—100％二氯甲烷—100％正己烷用每種溶劑沖洗至少10個柱體積，對于250mm×4.6mm的分析柱，合適的沖洗流速是1～2ml/min。最后用10柱體積的異丙醇過渡，然后回到原來的流動相體系。
對受蛋白類污染的硅膠基質反相柱，純有機溶劑如乙腈或甲醇不能溶解多肽和蛋白質。由有機溶劑、緩沖液和酸,有時還加上離子對試劑等組成的配方清洗效果極佳，譬如用三氟乙酸水溶液和三氟乙酸/丙醇溶液對柱子重復進行梯度洗來再生；Bhadwaj和Day試驗了在250mm×46mm的柱子中注入100μL的三氟乙醇，再生效果良好。
清洗硅膠、CN和Diol等正相柱建議方法：先用20柱體積50：50正己烷/氯仿沖洗，然后用甲醇、二氯甲烷或者100%醋酸乙酯沖洗。對油脂類物質，可用異丙醇清洗。
