13、為何出現(xiàn)鬼峰
①進樣閥殘余峰－－每次用后用強溶劑清洗閥,改進閥和樣品的清洗；
②樣品中未知物－－處理樣品；
③柱未平衡－－重新平衡柱,用流動相作樣品溶劑（尤其是離子對色譜）；
④三氟乙酸（TFA）氧化－－每天新配,用抗氧化劑；
⑤水污染（反相）－－通過變化平衡時間檢查水質(zhì)量，用HPLC級的水。
14、為何出現(xiàn)峰拖尾
①柱超載－－降低樣品量，增加柱直徑采用較高容量的固定相；
②峰干擾－－清潔樣品，調(diào)整流動相；
③硅羥基作用－－加三乙胺，用堿致鈍化柱，增加緩沖液或鹽的濃度降低流動相pH值，純化樣品；
④柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效－－更換燒結(jié)不銹鋼，加在線過濾器，過濾樣品；
⑤柱塌陷或形成短路通道－－更換色譜柱，采用較弱腐蝕性條件；
⑥死體積或柱外體積過大－－連接點降至最低，對所有連接點作合適調(diào)整，盡可能采用細內(nèi)徑的連接管；
⑦柱效下降－－用較低腐蝕條件,更換柱,采用保護柱。
15、除了流速外，還有哪些因素能引起壓力改變
改變流動相組成和溫度；改變柱長、柱內(nèi)徑和填料粒度；柱突然阻塞壓力升高（正常情況下其它條件不變柱壓都是逐漸升高的）。
16、什么是強溶劑、弱溶劑
改變流動相的組成或溶劑溶劑強度就可以改變峰容量因子和保留時間。在一定條件下，減少保留時間或縮短分析時間的溶劑為強溶劑，增加保留時間或延長分析時間的溶劑為弱溶劑。
17、怎樣才會使峰位發(fā)生重排
在分析多組分樣品時，僅改變流動相的強度（組成百分比）而不改變其組成，一般僅僅改變所有組分的保留時間，不會發(fā)生峰位的重排。
下列條件改變可能發(fā)生峰位重排：流動相中換了強溶劑；pH值的改變；柱填料的改變；柱溫的改變；流動相的組成改變（如，加入離子對試劑三乙基胺等）。
18、除了在線脫氣，常用的實驗室脫氣方式還有哪些
加熱回流脫氣，脫氣效果最佳，但無法保持；氦脫氣，此方法脫氣效果佳，能除去百分之九十以上的空氣，但氦氣價格太貴，所以用的不多；真空脫氣，效果僅次于氦脫氣，但脫氣過程中容易造成樣品溶液揮發(fā)損失；超聲脫氣，只能脫去約百分之三十的空氣，但在實驗室中最常用。目前還是盡量爭取用在線脫氣，方便且效果好。
19、評價一個色譜柱的最基本指標(biāo)有那些
評價一根色譜柱的基本指標(biāo)是：塔板數(shù)、峰不對稱因子、柱壓降、適用范圍和鍵合相濃度以及峰容量。
20、為何出現(xiàn)峰展寬
①樣品體積過大－－用流動相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15% ；
②在進樣閥中造成峰擴展－－進樣前后排出氣泡以降低擴散 ；
③數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢－－設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于10點 ；
④檢測器時間常數(shù)過大－－設(shè)定時間常數(shù)為感興趣第一峰半寬的10% ；
⑤流動相粘度過高－－增加柱溫,采用低粘度流動相；
⑥檢測池體積過大－－用小體積池,卸下熱交換器；
⑦保留時間過長－－等度洗脫時增加強溶劑含量,也可用梯度洗脫；
⑧柱外體積過大－－將連接管徑和連接管長度降至最小；
⑨樣品過載－－進小濃度小體積樣品。
21、色譜雙峰產(chǎn)生的可能及判斷和處理
HPLC分析中，在色譜柱正常，樣品靈敏度足夠，分析方法合適，色譜峰在出峰時間較短的條件下（不包括梯度），峰型應(yīng)對稱而尖銳。但是，在對樣品了解程度不夠，方法不妥，樣品處理方法及進樣方式不合理下，會出現(xiàn)各種意想不到的問題，而對色譜峰難以作出合理的解釋，尤其對于新手更是如此。色譜雙峰指的是明是一種物質(zhì)，但在色譜圖中出現(xiàn)雙峰，而表明含二種物質(zhì)。出現(xiàn)這種情況分為四種原因。
1)色譜柱
如果你分析樣品時發(fā)現(xiàn)每個色譜峰都雙峰出現(xiàn)（出峰越快，雙峰的可能性會減少），尤其采用單一純物質(zhì)時，可以肯定色譜柱出問題－柱頭受損或柱頭固定相變臟或流失。如果進樣量少，原來色譜柱正常，色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰，不一定拖尾，這一般應(yīng)是柱頭受堵，將色譜柱反過來接，用流動相沖洗或酸洗或其它溶劑，將堵在柱頭的殘留物沖掉，再反過來，一般情況下就行了。當(dāng)然不反沖，正沖有時也會正常的。如果峰拖尾，雙峰強弱相差不大，柱頭固定相變臟或流失可能性更大，這是可以將進樣那頭擰開，將微孔濾片超聲，柱頭刮去一部分填料，重新填上新填料擰緊，不過這種活，需要一定技術(shù)，同時不能老干那種事，否則用不了幾次，色譜柱就會應(yīng)柱效很低而報廢。
2)溶劑極性及進樣量
許多HPLC分析者對此可能不以為然，一般的 HPLC的書籍和文獻都不會提到這方面的內(nèi)容，而這確是雙峰產(chǎn)生的一個很重要的原因。目前HPLC分析多為反相色譜，流動相多為甲醇、乙腈、水，加各種添加劑以改善分離性能。樣品一般用與流動相相溶的溶劑溶解。最佳的溶解方法是用流動相溶解，但是很多情況是不一致的。當(dāng)用溶劑極性強度大的試劑，如純甲醇、純乙腈，純乙醇，而分析體系中以水為主，樣品進樣量大，如定量管為20ul，此條件下完全可以肯定，單一的純物質(zhì)出雙峰，第二峰比第一峰小（每次都不太一樣），且拖尾，保留時間會提前（相對進樣量少而言），將進樣量減少一半以上，峰型將變?yōu)檎！＿@是樣品的溶劑與流動相極性相差太大，而流動相來不及將其稀釋達到平衡造成的。上面提到進樣量造成雙峰的一個原因，另一個原因是，進樣量不一定大，但絕對量很大，色譜圖上的雙峰緊靠在一起，基本上齊高，不拖尾（如果出峰很快，也可能是色譜柱問題）。將樣品稀釋再進樣就可以了，這是由于進樣量過大，色譜柱過載造成的。
3)樣品的特性
有些樣品由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點，存在互變異構(gòu)現(xiàn)象，而這種互變異構(gòu)體無法分開，而是以一個動態(tài)平衡存在。在色譜分析時，在一個特定的條件下，一種物質(zhì)將出現(xiàn)雙峰，雙峰靠的很近，基本齊高，不拖尾，條件稍一變化，尤其pH，雙峰現(xiàn)象將消失，如，紅霉素等。有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰，但在LC-MS下，用質(zhì)譜檢測器，其質(zhì)譜的總離子流圖上較明顯，例如，我分析過的農(nóng)藥啶蟲瞇（吡蟲清）。
4)參數(shù)
記錄的參數(shù)一般都內(nèi)定的，不必修改，但GC和HPLC的參數(shù)是不完全一致的，例如，C－R3A數(shù)據(jù)記錄儀上的一般記錄時間間隔GC為2ms，HPLC為5ms，如果記錄間隔時間縮短，一個峰將變?yōu)槎€峰或更多。
22、為什么在實驗過程中有時會出現(xiàn)倒峰
所用的流動相在檢測波長下有吸收，而進在此波長下沒有吸收或吸收低于流動相的溶液，在流動相中會出現(xiàn)洞穴，通過柱后出現(xiàn)倒峰。
23、為何會出現(xiàn)“胖”峰和平頭峰，怎樣避免
用比流動相強度大的大體積樣品進樣，通常會損害色譜圖的質(zhì)量，而出現(xiàn)“胖”峰和平頭峰。應(yīng)遵循下列規(guī)則選用溶劑溶解樣品：A最好用流動相溶解樣品進樣。B用大體積弱溶劑溶解樣品，如反相色譜中用水溶解樣品進樣，主要缺點是每次進樣后在色譜圖的開頭出現(xiàn)大的負峰，有時還波及到樣品峰。C需要時用強溶劑溶解進樣。
24、前延峰的發(fā)生及處理
因柱溫問題很易引起前延峰，有些樣品在常溫下分離可見前延峰，提高溫度后前延峰的現(xiàn)象消失。在離子對色譜中，前延峰的另一個原因是用非流動相作樣品溶劑。因此在離子對色譜中要求僅用流動相溶解樣品，而且進樣量不要太大，否則會導(dǎo)致前延峰或其它問題。在RP-HPLC中樣品溶液的強度大于流動相引起前延峰。增加流動相的強度，減少樣品溶液的強度，在離子對色譜中增加離子強度，可以克服前延峰的效應(yīng)。此外使用流動相溶解樣品是解決的最簡單實用的方法。
25、如何簡單判斷比例閥是否內(nèi)漏
設(shè)定泵使用一個單獨通路（A），打開Purge閥，流速5mL/min，提起其他溶劑瓶內(nèi)的溶劑過濾頭直至離開液面，觀察這些通路（B、C、D）內(nèi)的溶劑是否隨著流動，正常時均不應(yīng)流動。
26、峰變寬的原因
A在使用過程中柱本身退化，逐漸降低柱效。
B柱外峰寬效應(yīng)。一根很好的專用柱用于另一液相色譜系統(tǒng)引起塔板數(shù)降低，說明新系統(tǒng)有很大的柱外峰寬效應(yīng)。
C化學(xué)效應(yīng)，多數(shù)是流動相和固定相相互作用所致，改變流動相可使寬峰有所改善。
27、柱平衡慢的常見原因
柱平衡慢的常見原因是，組分在舊的或新的流動相中對柱吸附強，或者在新的流動相中濃度小甚至為零。A流動相含有胺改良劑；B流動相含有離子對試劑；硅膠柱；流動相中有四氫呋喃。可考慮采用專用柱用于特殊的方法，不用時將柱折下來，注滿適當(dāng)?shù)娜軇┗蛄鲃酉?，密封保管，不再作其它的分析?/span>
28、對內(nèi)標(biāo)物的要求有哪些
A.內(nèi)標(biāo)物的結(jié)構(gòu)或理化性質(zhì)應(yīng)與被分析組分相似或相近；
B.內(nèi)標(biāo)物的保留值應(yīng)稍大于或小于被分析物的保留，不能相差過大；
C.內(nèi)標(biāo)物的峰要與所有被分析物的峰有良好的分離度（R大于1.5），不能讓內(nèi)標(biāo)物成了干擾物；
D.無結(jié)構(gòu)相似的內(nèi)標(biāo)物，可用保留相近的內(nèi)標(biāo)物；E儀器對分析物的響應(yīng)與內(nèi)標(biāo)基本一致，出峰面積大小不能相差懸殊。
29、什么是HPLC的“無限直徑效應(yīng)”
在HPLC分析中由于使用了高效微粒固定相及高壓流動相，樣品以柱塞式注入色譜柱后，因柱的阻力大，樣品分子在柱中的分子擴散很小，直至它從色譜柱流出也未與色譜柱內(nèi)壁接觸，因而引起的色譜峰形擴展很小，能保持高柱效。
30、如何評價一臺檢測器
A.噪聲：通常噪聲是指由儀器的電氣元件、溫度波動、電壓的線性脈沖以及其他非溶質(zhì)作用產(chǎn)生的高頻噪聲和基線的無規(guī)則波動；
B.基線飄移：漂移是基線的一種向上或向下的緩慢移動，可在較長時間（0.5~1h）內(nèi)觀察到。它可掩蔽噪聲和小峰。漂移與整個液相色譜系統(tǒng)有關(guān)，而不僅是由檢測器引起的；
C.靈敏度（最小檢出濃度或最小檢出量）：在一個特定分離工作中，檢測器是否有足夠的靈敏度是十分重要的。當(dāng)比較檢測器時，常使用敏感度這一性能指標(biāo)。敏感度，即指信號與噪聲的比值（信噪比）等于2時，在單位時間內(nèi)進入檢測器的溶質(zhì)的濃度或質(zhì)量；
D.線性范圍：在進行定量分析時，希望檢測器有寬的線性范圍，以便在一次分析中可同時對主要組分和痕量組分同時進行檢測；
E.檢測器的池體積：它應(yīng)小于最早流出的死時間色譜峰的洗脫體積的1/10，否則會產(chǎn)生嚴(yán)重的柱外譜帶擴展。
以上就是譜析色譜工程師對高效液相色譜儀HPLC 30個常見問題對策介紹，你是否對液相色譜儀使用有了新的啟發(fā)和思考？如還有疑惑和難點請致電公司色譜技術(shù)人員，亦可登錄公司網(wǎng)站http://www.iamgenius.com.cn在線咨詢工作人員，我們將一一為您解答。
